伊氏錐蟲探針法熒光定量PCR試劑盒設計引物原則
點擊次數:315 更新時間:2024-08-12
伊氏錐蟲探針法熒光定量PCR試劑盒:
1、引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。
2、引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。
3、引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3’端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。
5、引物3’端的堿基,特別是zui末及倒數*個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
6、引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列zui有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很有好處。
7、引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。