溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結(jié)合,必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比,即溫度越高,則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2~8℃。在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn):
1、要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間
一般來(lái)說(shuō),加完樣本和/或反應(yīng)試劑后,將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí),孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃,需要一定的時(shí)間,尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下,這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng),而在臨床實(shí)驗(yàn)室中,很少有人注意這個(gè)問題,通常是將微孔板一放入溫箱即開始計(jì)時(shí),這樣就很容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠,弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個(gè)問題,就是在每一年的冬季總有那么一個(gè)多月的時(shí)間,在做HBsAg測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控中,測(cè)定由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心供應(yīng)的1 ng/ml弱陽(yáng)性樣本時(shí),總是測(cè)不出來(lái),不知原因?yàn)楹危窟@可能就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān),此時(shí)微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37℃溫育時(shí)間不夠,以致弱陽(yáng)性樣本測(cè)定為陰性。因此,為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間,臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)(不同室溫下)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃,從而適當(dāng)延長(zhǎng)板條在溫箱中的放置時(shí)間。具體的做法是,用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測(cè)量觀察即可。
2、溫育溫度的選擇
在有的ELISA試劑盒的說(shuō)明書中,指出溫育溫度可有兩種,例如,一種是37℃下1小時(shí),另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測(cè)定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來(lái)看,在較低的溫度下反應(yīng)較長(zhǎng)的時(shí)間最為全。如2~8℃下反應(yīng)24小時(shí)。較高的反應(yīng)溫度,由于分子運(yùn)動(dòng)的加憐惜,反應(yīng)時(shí)間縮短,這一點(diǎn)對(duì)分子含量較多的強(qiáng)陽(yáng)性樣本的測(cè)定沒有問題,但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢的可能。因此,我們建議在臨床ELISA測(cè)定中盡量使用較低溫育溫度較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件。
3、“邊緣效應(yīng)"的排除
以前在使用96孔板的ELISA測(cè)定中,常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)",即外周孔顯色較中心孔深,產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)"的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同。但有研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯y(tǒng)i 烯本身為不良熱導(dǎo)體,在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,板也升溫時(shí),在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí),將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)",并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。
總而言之,在臨床ELISA測(cè)定中,要保證好的測(cè)定效果,可采用下述簡(jiǎn)單辦法來(lái)確保溫育條件,即盡量采用水浴,溫育中讓微孔板浮于水面上,或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?,放于溫箱中,這樣就會(huì)因?yàn)榘鍡l孔底部直接與37℃水或濕布的接觸,以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度,而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。