細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備： 1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。 中文名稱：臺盼藍染色法細胞活力檢測試劑盒 英文名稱：Typan Blue Staining Cell Viability Assay Kit 產品規(guī)格：100T 產品貨號：BJ-01X6457 本試劑盒各組分均以無菌形式提供，可直接用于細胞實驗。臺盼藍（Trypan Blue），一種偶氮、親水性酸性藍色染料，可透過死亡細胞和垂死細胞的細胞膜，將其染成藍色，而活細胞由于其細胞膜的完整性，可將臺盼藍排斥在外，因此，通過顏色的變化即可將活細胞（活細胞呈透明無色）和死細胞鑒別開來，基于此原理，本品廣泛用于細胞活性水平的常規(guī)評估。臺盼藍還可染色膠原和淀粉樣蛋白。臺盼藍與蛋白結合形成的復合物可發(fā)出紅色熒光。另外，臺盼藍（合適濃度）還常用來淬滅細胞表面的自熒光或者其他熒光信號。 使用方法 1）對于懸浮細胞，離心收集細胞，對其充分清洗后，加入適量細胞重懸液重懸細胞制成單細胞懸液；對于貼壁細胞，先用消化細胞，再按照懸浮細胞的方法制備單細胞懸液。 2）取0.1ml單細胞懸液，按照1:1比例與0.1ml 0.4%臺盼藍染色液充分混勻，室溫染色3~10min。 【注】：因臺盼藍具有細胞毒性，染色時間過久會導致部分死細胞染色，干擾計數(shù)。通常染色3min即可。 3）取少量上述染色細胞加入血細胞計數(shù)板，于顯微鏡低倍鏡下計數(shù)，分別計算著色細胞（即損傷細胞和死細胞）和總細胞。 【注1】：用移液槍加染色細胞時，沿著蓋玻片的邊緣輕輕加液使其*覆蓋住整個小室。不可過量加液或者不足量。 【注2】：1mm2方格內細胞數(shù)通?？刂圃?0-50 cells，當細胞數(shù)超過200個，需重新調整稀釋倍數(shù)。 4）按照以下公式來計算細胞數(shù)目和活細胞百分比， a，計算每ml細胞數(shù)目：Cells/ml=1mm2大方格內的平均細胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×104；【注】：此時的稀釋倍數(shù)為：步驟2所取的單細胞懸液與臺盼藍染色液混合后的稀釋倍數(shù) b，總細胞數(shù)目：Total cells=（Cells/ml）×初制備單細胞懸液的總體積 c，細胞活力值：Viability（%）=（總細胞數(shù)-總著色細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100 【注】：通常情況，健康的對數(shù)期培養(yǎng)細胞，活細胞至少占到95%。 儲存條件：室溫，有效期2年 |
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。 操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) Canine Norovirus 犬諾瓦克病毒LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Bacillus coagulans凝結芽孢桿染料法熒光定量PCR試劑盒 種源性檢測 50次 低溫 負20度 一年 3-4周 Chikungunya Virus(CHIKV)基孔肯尼雅病毒RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus(MERS-CoV)中東呼吸綜合征探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Taenia solium鏈狀帶絳蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Aujeszky's Disease Virus(ADV)奧葉茲基氏病病毒LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Mink Enteritis Virus(MEV)水貂病毒性腸炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Mycobacterium malmoenes瑪爾摩分枝桿探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 鯊魚源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Radix astragali preparata炙黃芪探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Ochroconis gallopava奔馬赭霉LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Nodus nelumbinis rhizomatis藕節(jié)LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 臺盼藍染色法細胞活力檢測試劑盒細胞葡萄糖激（glucose kinase）比色法定量檢測試劑盒 20次 固氮根瘤菌培養(yǎng)基 英文名稱：Nitrogen-fixing Rhizobium medium 產品規(guī)格：250g 體液糖類總量鐵比色法定量檢測試劑盒 20次 免疫細胞化學AP聯(lián)NBT/BCIP*間接檢測試劑盒（含一抗和AP二抗） 10次 血液脯氨酰肽（prolinase）比色法定量檢測試劑盒 20次 組織多巴胺（dopamine）比色法定量檢測試劑盒 20次 食物總抗氧化能力（TAC）比色法（DDPH）定量檢測試劑盒 50次 組織組蛋白脫乙酰化（HDAC）總活性比色法定量檢測試劑盒 20次 營養(yǎng)瓊脂 英文名稱：Nutrient Agar 產品規(guī)格：250g 孟加拉紅培養(yǎng)基顆粒 英文名稱：Rose Bengal Medium 產品規(guī)格：300ml/袋*10 載玻片細胞ERK蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒 10/20次
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