操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱(chēng)：EGFR抑制劑(Sapitinib)

英文名稱(chēng)：Sapitinib

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7947

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

人 NUDC 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠睪酮(T)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ALX1 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高鐵血紅蛋白(MHB)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 BRCC3 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 AKTIP 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高敏甲狀腺素(u-T4)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

人 DGUOK 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高密度脂蛋白(HDL-C)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ATG5 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高靈敏度促甲狀腺激素(U-TSH)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 HSD17B14 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高爾基蛋白73(GP-73)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 LRRC18 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠高半胱(Hcy)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

人 EAF2 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠肝脂(HL)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 DCUN1D1 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 PEX11B 基因全長(zhǎng)ORF克隆小鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-MET/HGFR)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

EGFR抑制劑(Sapitinib)細(xì)胞增殖和遷移抑制劑(Silibinin)  1mL(10mM)|100mg|500mg  SilibininPSB（鹽緩沖液pH7.2）  9ml*20支/包

SGK抑制劑(GSK 650394)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  GSK 65039425g 抗壞血酸 L-Ascorbic Acid 室溫避光保存

TNF-α轉(zhuǎn)換酶TACE抑制劑(TAPI-1)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg  TAPI-1500mL Tris-Caps Buffer,10X Tris-Caps Buffer,10X 常溫保存

Rho抑制劑（Rhosin鹽酸鹽）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg  Rhosin hydrochloride50次 SDS-PAGE 樣品制備試劑盒 Sample Preparation Kit for SDS-PAGE -20℃保存

JMJD2去甲基酶抑制劑(ML324)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  ML3242 ug pTrcHis B pTrcHis B 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

G12C mutant K-Ras蛋白抑制劑（K-Ras G12C-IN-2）  1mg  K-Ras G12C-IN-21 管 SMD1168H酵母菌 SMD1168H Yeast Strain -80℃保存

由bFGF或VEGF誘導(dǎo)的體內(nèi)血管生成抑制劑(Thalidomide)  1mL(10mM)|200mg|500mg  Thalidomide2 ug pEasy-Blunt Simple pEasy-Blunt Simple 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

procaspase-3激活劑(PAC-1)  1mL(10mM)|10mg|50mg  PAC-1TPY瓊脂培養(yǎng)基 TPY Agar Medium 250g

Hsp90抑制劑（NVP-HSP990）  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  NVP-HSP9901g 四鹽酸精胺 Spermidine 4HCl 室溫保存

NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)激活劑（CDDO-EA）  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  CDDO-EA50T 幽門(mén)螺旋桿菌PCR檢測(cè)試劑盒  低溫運(yùn)輸，-20℃保存

USP7/USP47抑制劑(USP7/USP47 inhibitor)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  USP7/USP47 inhibitor200 mL 小鼠粒細(xì)胞分離液1.128 Cell Separation Solution -20℃保存