操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

中文名稱：CDK1/CDK2/CDK9抑制劑(AZD-5438)

英文名稱：AZD-5438

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X7418

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

Alfalfa Mosaic Virus(AMV)苜?；ㄈ~病毒RT-PCR試劑盒 植物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周PMPCB  線粒體導(dǎo)肽水解β抗體 規(guī)格: 0.2mlRabbit anti-mouse Kappa light chain/PE-Cy3  PE-Cy3標(biāo)記的兔抗小鼠k鏈 規(guī)格: 0.1ml

甲型流感（）H5/H7/H9亞型三重探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒（無(wú)） 定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周Phospho-Smad1/5(Ser463/465)  磷酸化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad-1/5抗體 規(guī)格: 0.1mlrHPV  重組人瘤毒抗體 規(guī)格: 0.2ml

Influenza Virus A甲型流感（）病毒H7亞型RT-LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周Phospho-Insulin Receptor Beta(Tyr1345)  磷酸化胰島素受體β抗體 規(guī)格: 0.1mlKLH  藍(lán)蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

乳酸桿探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周EPHA10  酪蛋白激受體A10抗體 規(guī)格: 0.1mlRabbit Anti-human IgG/Bio  標(biāo)記的兔抗人IgG 規(guī)格: 0.1ml

Fructus toosendan川楝子染料法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周REG4/RELP  再生基因蛋白4抗體 規(guī)格: 0.2mlPhospho-TAK1(Ser192)  磷酸化轉(zhuǎn)化生因子β活化激1 規(guī)格: 0.1ml

Parechovirus(PeV) 雙埃柯病毒LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周CDX1  尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子1抗體 規(guī)格: 0.2mlIQCK  IQCK蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Europe Strain (PRRSV Europe)豬生殖與呼吸綜合癥病毒歐洲株探針?lè)晒舛縍T-PCR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周phospho-RGS19(Ser151)  磷酸化G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子19抗體 規(guī)格: 0.1mlE-cadherin/CD324  上皮鈣粘附分子抗體 規(guī)格: 0.1ml

Rhizoma wenyujin concisum片姜黃探針?lè)≒CR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-4周alpha-L-arabinofuranosidase  果桃α-L-阿拉伯呋喃糖苷抗體 規(guī)格: 1mlMTA1  瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Oliveros virus(OLVV)奧利華斯病毒RT-LAMP試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周Claudin 6  緊密連接蛋白6抗體 規(guī)格: 0.2mlGFR Alpha-1  GDNF家族受體α-1抗體 規(guī)格: 0.1ml

Bonamia spp.包納米蟲(chóng)屬通用探針?lè)晒舛縋CR試劑盒 動(dòng)物病原微生物檢測(cè)（科研用）/定做種屬檢測(cè)試劑盒 50次 低溫 負(fù)20度 一年 2-3周Rabbit Anti-mouse IgG-Fc/Cy5  Cy5標(biāo)記的兔抗小鼠IgG-Fc 規(guī)格: 0.1mlRabbit anti-Goat IgM whole serum  兔抗羊IgM抗清 規(guī)格: 1ml

CDK1/CDK2/CDK9抑制劑(AZD-5438)I類HDAC抑制劑(Pimelic Diphenylamide 106)

人類DNA連接酶抑制劑(L189)

轉(zhuǎn)酮醇酶(TK)抑制劑（N3PT）

GnRH激活劑(Nafarelin)

Caspase-3抑制劑（Ac-DEVD-CHO）

RIP2抑制劑（RIP2 kinase inhibitor 2）

多重激酶抑制劑(R1530)

CK1ε/CK1δ和p38α抑制劑(TA-01)

核磷蛋白抑制劑（NSC348884）

Syk抑制劑(PRT-060318)

TPase抑制劑(Tipiracil)