細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：Mnk1抑制劑(CGP 57380)

英文名稱：CGP 57380

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7927

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 RAB2B 基因全長ORF克隆小鼠免疫球蛋白G4(IgG4)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 ABCA3 基因全長ORF克隆小鼠免疫球蛋白G(IgG)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 RAB8B 基因全長ORF克隆小鼠免疫球蛋白E(IgE)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 ARL15 基因全長ORF克隆小鼠免疫球蛋白D(IgD)免疫試劑盒*直銷

人 HPGDS 基因全長ORF克隆小鼠免疫球蛋白A(IgA)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 NRSN1 基因全長ORF克隆小鼠輪狀病毒(RV)抗原(Ag)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 COMMD1 基因全長ORF克隆小鼠卵清蛋白特異性IgG(OVA sIgG)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

人 CCDC12 基因全長ORF克隆小鼠卵清蛋白特異性IgE(OVA sIgE)免疫試劑盒*直銷

人 RBP5 基因全長ORF克隆小鼠卵泡抑素(FS)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

人 SH2D1B 基因全長ORF克隆小鼠硫脂(SULF)抗體免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

人 PCBD2 基因全長ORF克隆小鼠硫氧化還原蛋白(Trx)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

Mnk1抑制劑(CGP 57380)REV-ERBα/β激動(dòng)劑(SR9009)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  SR9009100mL AMP Buffer，0.5M，pH10.5  AMP Buffer，0.5M，pH10.5  常溫保存

Hsc70/Hsp70新型小分子抑制劑(VER-155008)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  VER-15500850uL 電泳級耐熱型SYBR染料 SuperSYBR，EG 常溫閉光

甲基轉(zhuǎn)移酶SETD7抑制劑(PFI-2鹽酸鹽)  1mL(10mM)|10mg|50mg  PFI-2 hydrochloride2 ug pGEMEX-1 pGEMEX-1 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

Cdc42抑制劑(ML141)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  ML141抗生素檢定培養(yǎng)基9號 Antibiotic Agar NO.9 250g

VEGF和PDGFR受體家族抑制劑(Linifanib)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  Linifanib1瓶 DLD-1細(xì)胞株 DLD-1 低溫運(yùn)輸和保存

Wip1磷酸酶抑制劑(GSK 2830371)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  Wip1phosphatase InhibitorBCYE-CYS瓊脂平板（9cm） BCYE-CYS Agar 10個(gè)/包

激光激酶抑制劑(Danusertib)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  aurora kinase inhibitor1000U T4 RNA連接（T4 RNA Ligase) T4 RNA Ligase -20℃保存

蛋白激酶CK2抑制劑(TBB)  1mL(10mM)|10mg|50mg  TBB乳酸桿菌選擇性瓊脂 Lactobacillus Selective Agar 250g

胸苷酸合成酶抑制劑(Raltitrexed)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  thymidylate synthase inhibitor1 管 JM103大腸桿菌 JM103 E.coli Strain -80℃保存

Pim抑制劑(SGI-1776)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg  SGI-17762 ug pPinPoint-Xa3 pPinPoint-Xa3 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

CD13/APN/LTA4H抑制劑(Bestatin)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  Bestatin乳糖發(fā)酵管  20支