特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)田鼠痘病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
儲存條件：-20℃以下，有效期12個月。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。

使用方法：
一、樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照菌檢驗要求進行。
2、血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
原理:
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。

2,5-二巰-1,3,4-噻二唑分子式：150.24英文名稱：2,5- two -1,3,4- two：1072-71-5分子量： C2H2N2S3

2,5-二-1,3,4-二唑分子式：222.25英文名稱：2,5- two -1,3,4- two：725-12-2分子量： C14H10N2O

2--5-氯吡分子式：128.56英文名稱：2- amino -5-：1072-98-6分子量： C5H5ClN2

4--2,2,6,6-四甲1-氧自由分子式：181.26英文名稱：Four 4- cyano -2,2,6,6- methyl piperidine 1- oxygen radicals：38078-71-6分子量： C10H17N2O

2-氯-4-氟吡分子式：131.53英文名稱：2- chloride -4-：34941-91-8分子量： C5H3ClFN

2-溴-5-吡分子式：183.01英文名稱：2- bromo -5- cyanopyridines：139585-70-9分子量： C6H3BrN2

月桂酸鉀分子式：238.41英文名稱：Potassium potassium：10124-65-9分子量： C12H23KO2

吳茱萸內(nèi)酯英文名稱：Wu Zhuyu分子式：470.5116分子量：C26H30O8：1180-71-8

3--4-甲吡分子式：108.14英文名稱：3- amino -4- methyl pyridine：3430-27-1分子量： C6H8N2

4-溴-2-氟吡分子式：175.99英文名稱：4- bromide -2-：128071-98-7分子量： C5H3BrFN

鈹試劑Ⅰ英文名稱：Beryllium reagent分子式：分子量：：

田鼠痘病毒探針法熒光定量PCR試劑盒人神經(jīng)少突起前質(zhì)膠質(zhì)細胞*培養(yǎng)基100mL

無翅型MMTV整合位點家族成員3(WNT3)重組蛋白英文名稱：Recombinant Wingless Type MMTV Integration Site Family, Member 3 (WNT3)

P19(小鼠畸胎瘤細胞)5×106cells/瓶×2

SHG-44 (人膠質(zhì)瘤細胞)5×106cells/瓶×2

釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae熱帶假絲酵母 Candida tropicalis

小單孢菌 Micromonospora sp.戊糖桿菌 Lactobacillus pentosus

趨化因子C-C-基元受體3(CCR3)重組蛋白英文名稱：Recombinant Chemokine C-C-Motif Receptor 3 (CCR3)

小鼠巨噬細胞英文名稱：J774A.1

肌細胞生成素(MYOG)重組蛋白英文名稱：Recombinant Myogenin (MYOG)

小鼠白血病細胞英文名稱：M1

THP-1(人髓系白血病單核細胞)人腎細胞腺細胞