特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)副溶血性弧菌保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。
儲存條件：-20℃以下，有效期12個月。

使用方法：
一、樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預培養(yǎng)按照樣品的采集與預培養(yǎng)按照菌檢驗要求進行。
2、血液樣品：用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

原理:
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。

α,α'-雙(4-羥-3,5-二甲)-1,4-二異丙分子式：402.58英文名稱：Alpha, alpha '- bis (4- hydroxy -3,5- DIMETHYLPHENYL) -1,4- two Cumene：36395-57-0分子量： C28H34O2

2-氯-6-硝甲分子式：171.58英文名稱：2- -6- nitro toluene：83-42-1分子量： C7H6ClNO2

巴馬汀英文名稱：Martin hydrochloride分子式：387.86分子量：C21H22ClNO4：10605-02-4

2-羥-3-硝-4-氯吡分子式：174.54英文名稱：2- hydroxy -3- nitro -4-：165547-79-5分子量： C5H3ClN2O3

1,3,5-三(2-噻吩)分子式：324.47英文名稱：1,3,5- three (2- Sai Fenji) benzene：15509-95-2分子量： C18H12S3

2-羥-6-氯喹喔啉分子式：180.59英文名稱：2- hydroxy -6- dichloro quinoxaline：2427-71-6分子量： C8H5ClN2O

高鐵試劑英文名稱：High iron reagent分子式：351.12分子量： C9H6INO4S：547-91-1

3,3’-二二砜分子式：248.3英文名稱：3,3 '- two - two amino group：599-61-1分子量： C12H12N2O2S；(H2NC6

4-巰吡分子式：111.16英文名稱：4- thiol：4556-23-4分子量： C5H5NS

四氟硼酸鐵分子式：272.84英文名稱：Iron tetrafluoroborate：1282-37-7分子量： C10H10BF4Fe 10*

5-溴-2-(三正丁錫)吡分子式：447英文名稱：5- -2- bromide (tributylstannyl) pyridine：611168-46-8分子量： C17H30BrNSn

副溶血性弧菌探針法熒光定量PCR試劑盒Hela S3(人宮頸細胞)小鼠皮層神經(jīng)膠質(zhì)細胞（EGFP標記）

小鼠成骨細胞*培養(yǎng)基100mL

小鼠白血病細胞英文名稱：L1210

WPMY-1(人正常前列腺基質(zhì)永生化細胞)釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

桿菌屬 Lactobacillus sp.釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae

HT-29, 人結腸細胞

褐球固氮菌 Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis鏈霉菌 Streptomyces sp.

人胃細胞異常漢遜酵母 Hansenula anomala

豇豆慢生瘤菌 Bradyrhizobium vigna惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida

人非小細胞肺細胞英文名稱：NCI-H358

鈉結晶紫增菌/Sodium Chloride Violet Purple Enrichment Broth副溶血弧菌的選擇性增菌培養(yǎng)250克國產(chǎn)/進口

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此，擴增不同的基因需要設計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。設立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。